特點(diǎn)
全長的第一鏈cDNA 產(chǎn)量高，最長可合成13 kb的cDNA。
增加的反應(yīng)溫度范圍：42-55°C。
配套提供RiboLock™ RNase Inhibitor。
完全 一 試劑盒提供oligo(dT)18和隨機(jī)六聚體引物。
應(yīng)用
第一鏈cDNA合成，作為RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR模板(1, 2)。
構(gòu)建全長cDNA文庫。
制備雜交用探針。
aRNA合成。
說明
RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit 是一個(gè)完整的以RNA為模板高效合成第一鏈cDNA的反應(yīng)體系。該試劑盒可合成長達(dá)13 kb的cDNA。
試劑盒使用RevertAid™ H MinReverse Transcriptase。該酶由于點(diǎn)突變而完全消除了RNase H活性。
因此，該酶不能降解第一鏈cDNA合成時(shí)形成的RNA-DNA復(fù)合體中的RNA。該酶在寬溫度范圍(42-55°C)保持活性，適合逆轉(zhuǎn)錄具有大量二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA。試劑盒配套提供的重組RiboLock™ RNase Inhibitor 有效保護(hù)RNA模板免于降解。該產(chǎn)品與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全兼容，因?yàn)樵?5°C時(shí)仍然保持活性。
試劑盒配套提供oligo(dT)18和隨機(jī)六聚體引物。oligo(dT)18與mRNA 的poly(A)尾選擇性結(jié)合。隨機(jī)六聚體引物轉(zhuǎn)錄無需poly(A) 尾，因此可轉(zhuǎn)錄mRNA的5’-端區(qū)域，也可以無poly(A)尾的RNA (micro RNAs)為模板合成cDNA。試劑盒也可使用基因特異性引物。
第一鏈cDNA可直接作為PCR (見RT-PCR操作說明書)、實(shí)時(shí)PCR或第二鏈cDNA合成(見操作說明書)的模板。
質(zhì)量控制
功能測試：以多聚腺苷酸RNA轉(zhuǎn)錄子為模板合成第一鏈cDNA(分別測試特異性引物、oligo(dT)18和隨機(jī)六聚體引物)。合成的cDNA作為后續(xù)PCR的模板。
組分
•RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase
•RiboLock™ RNase Inhibitor
•5X Reaction Buffer
•dNTP Mix, 10 mM each
•Oligo(dT)18 Primer
•Random Hexamer Primer
•Control GAPDH RNA
•Forward GAPDH Primer, 10 µM (5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3')
•Reverse GAPDH Primer, 10 µM (5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3')
•Water, nuclease free
參考文獻(xiàn)
1.Schmidt, A., Su, Y.H., et al., UPS1 and UPS2 from Arabidopsis Mediate High Affinity Transport of Uracil and 5-Fluorouracil, The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, 43, 44817-44824, 2004.
2.Papavinasasundaram, K.G., et al., Deletion of the Mycobacterium tuberculosis pknH Gene Confers a Higher Bacillary Load during the Chronic Phase of Infection in BALB/c Mice, Journal of Bacteriology, Aug., 5751-5760, 2005.