1 主要試劑
STR Pvimer Postive Control DNA
STR Buffer Allele Ladder
Gold Taq DNA Polymerase Rox-350
2 主要儀器
DNA擴(kuò)增儀（PE9700）
自動(dòng)測(cè)序儀（PE377）
微型高速離心機(jī)
GeneScan軟件
Geneotyper軟化
3 操作步驟
3.1 基因組DNA提取——鹽析法
3.1.1 操作流程
用方框圖形式，按照GeneScan技術(shù)的先后順序和技術(shù)要求、分割形成7個(gè)相對(duì)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)階段，以便合理安排分配試驗(yàn)時(shí)間，提高工作效經(jīng)。
3.1.2 操作步驟：
①取0.1ml血樣置于1.5ml EP管。
②加500μl TE緩沖液，充分混勻靜置5分鐘。
③13000rpm離心2分鐘，用無菌移液管移棄上清液。
④加TE緩沖液重復(fù)②、③步一遍，然后用紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB），重復(fù)②、③步兩遍。
⑤最后一次RCLB洗滌后，移去上清液，加入100μl DSP工作液，充分混勻直至沉淀塊碎。
⑥56℃孵育2小時(shí)。
⑦95℃孵育10分鐘。
3.1.3 純化DNA
①加35μl高氯酸鈉，混勻后13000rpm離心5分鐘，小心吸取上清液。
②加2.5倍體積冷無水乙醇，沉淀DNA，12000rpm離心8分鐘，棄上清液。
③加入1ml 70%乙醇洗滌DNA，10000rpm離心7分鐘，棄上清液。
④置超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥后，加入100μl ddH2O，置4℃保存，待用。
提取基因組DNA 純化DNA
（鹽析法）
DNA定量
擴(kuò) 增
電 泳
GeneScan
Genotyper
計(jì)算機(jī)分析處理
操作流程圖
3.2 DNA定量
3.2.1 配制0.8%瓊酯糖凝膠
3.2.2 將標(biāo)準(zhǔn)含量（20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl）的DNA樣品和分子量大小DNA參照物置于干熱器孵育5分鐘，稍離心。
3.2.3 將分子量大小DNA參照物、標(biāo)準(zhǔn)量DNA及待測(cè)DNA樣本各10μl依次加入膠中。
3.2.4 電壓150V、電泳30分鐘。
3.2.5 將膠置于紫外透測(cè)儀上，觀察結(jié)果并照像。
3.2.6 與標(biāo)準(zhǔn)量DNA比對(duì)，估算并記錄樣本DNA含量。
3.3 基因擴(kuò)增
反應(yīng)體系為10μl，其中樣本DNA 4.0μl，Master Mix 6.0μl。
3.3.1 根據(jù)定量結(jié)果將模板DNA量全部調(diào)至1ng/μl。
3.3.2 配制擴(kuò)增反應(yīng)液（Master Mix），（注：在冰上操作）。
STR 10×Buffer 4.58μl
STR 10×Primer 2.08μl
Taq DNA polymerase (5μ/μl) 0.17μl
以上反應(yīng)物混合后用8聯(lián)槍，加至每個(gè)樣品擴(kuò)增管中（在冰浴上操作）。
3.3.3 將模板DNA 4.0μl和已對(duì)照DNA4.0μl分別加入已標(biāo)記好的96孔薄壁擴(kuò)增管內(nèi)，混勻后加橡膠墊蓋緊管口，置PE 9700型擴(kuò)增儀中。
3.3.4 十個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置：
最初預(yù)變性95℃ 11min；94℃，1min；59℃ 1min；72℃，1min共28個(gè)循環(huán)，最后60℃，延伸45min；4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
3.4 電泳
采用美國(guó)PE公司制造的377A型自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行。
3.4.1 預(yù)電泳條件：時(shí)間20min，功率50W，電流13mA，電壓1KV。
3.4.2 FLS/G350混合液的配制。
FLS 3.6μl
Rox-350 0.4μl
以上反應(yīng)液混合后，用8聯(lián)槍分置在48孔擴(kuò)增管中。
3.4.3 DNA樣本處理：將擴(kuò)增產(chǎn)物用去離子水對(duì)倍稀釋后取3μl，分別加入標(biāo)記好有FLS/GS350混合液4μl的擴(kuò)增管中并混勻。在第1孔和第48孔加入1μl STR等位基因標(biāo)記物；第2孔和第47孔為已知對(duì)照DNA，第3～46孔為樣本DNA，操作全過程均在冰浴上進(jìn)行；混合物置PE9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行95℃，5min變性，然后放置冰浴中備用。
3.4.4 電泳：按照擴(kuò)增板上各樣本的排列順序，用8道加樣器吸取樣本0.8μl加至上樣槽中，在第1和48泳道中為L(zhǎng)adder，第2和47泳道為P·C，第3～46泳道為樣本DNA。
電泳條件：時(shí)間2小時(shí)30分鐘，功率200W，電流強(qiáng)度60mA，電壓30KV。
3.5 基因掃描
用GeneScan軟件將電泳收集的電泳圖譜信息經(jīng)過電子計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息。
3.6 基因分型
用Genotyper軟件，依據(jù)數(shù)據(jù)信息與設(shè)計(jì)等位基因分子大小標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)比較被定義。以美國(guó)PE公司的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物（Allele Ladder,AL）為參照物進(jìn)行分型，等位基因按重復(fù)次數(shù)命名，電泳圖譜中不同位點(diǎn)的等位基因顯示出不同顏色，同一位點(diǎn)的不同等位基因?yàn)橥环N顏色，它們的遷移率各不相同。電泳圖譜中的顏色分為紅、黃、藍(lán)、綠。紅色為Genescan-350[ROX]，是設(shè)計(jì)的等位基因分子量大小標(biāo)記物，在變性條件下產(chǎn)生的片段大小：50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350bp；黃色為NED，標(biāo)記的基因位點(diǎn)有D5S818，D13S317和D7S820；藍(lán)色為S-FAM，標(biāo)記的基因位點(diǎn)有D3S1358，VWA和FGA；綠色為JOE，標(biāo)記的基因位點(diǎn)有Amelogenin,TH01,TOPXt CAF1PO。