與基于細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比較，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括節(jié)約時(shí)間、提高具有功能的、可溶的、全長(zhǎng)蛋白的總體產(chǎn)量。此外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)更適用于激酶等毒性蛋白的表達(dá)、也可使用經(jīng)過(guò)修飾的tRNA來(lái)進(jìn)行標(biāo)記，在某特定位點(diǎn)摻入非天然的氨基酸。同時(shí)，這些系統(tǒng)還可以用于高通量實(shí)驗(yàn)(1)。我們提供完備的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，為研究者提供了多種選擇，可用于進(jìn)行蛋白的特征描述，包括免疫沉淀、Pull-down實(shí)驗(yàn)和酶學(xué)檢測(cè)。

　　選擇一個(gè)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，最主要的幾點(diǎn)考慮因素包括細(xì)胞提取物或裂解物的來(lái)源、模板以及期望的蛋白產(chǎn)量。本文介紹的信息可幫助研究者選擇適合其實(shí)驗(yàn)體系和下游應(yīng)用的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

考慮因素—  模板

　　在使用插入片斷或載體進(jìn)行真核細(xì)胞系統(tǒng)蛋白表達(dá)時(shí)，有以下幾個(gè)因素需要考慮：(i)ATG起始密碼子應(yīng)該是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的第一個(gè)ATG密碼子；(ii)理想化而言，在啟動(dòng)子之后，ATG應(yīng)該包含在Kozak共有序列之內(nèi)；(iii)在模板序列的3'端應(yīng)包含終止密碼子；(iv)終止密碼子之后應(yīng)帶有合成的多聚A尾(2)。此外，使用TNT  T7麥胚偶聯(lián)系統(tǒng)(TNT  T7 Coupled Wheat Germ System)時(shí)，載體還應(yīng)包含一個(gè)T7終止子序列或該載體呈線(xiàn)性化。

　　在原核系統(tǒng)中，起始密碼子的選擇幾乎無(wú)一例外地依賴(lài)于核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal binding site, RBS)的存在，這個(gè)位點(diǎn)包含了閱讀框架的起始信號(hào)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)能夠大大提高原核細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。原核系統(tǒng)不識(shí)別位于ATG起始密碼子上游的任何