Western Blotting依然是目前分離和檢測蛋白最常用到的一種技術(shù)方法，但是要將這種技術(shù)變成你的有利手段，并不容易。因此優(yōu)化實驗操作手冊至關(guān)重要，但是，正如Bio-Rad成像系統(tǒng)市場經(jīng)理Ryan Short所說的，“大多數(shù)研究人員并不是Western blot技術(shù)專家——他們要解答的是更大的問題”，Ryan繼續(xù)說道，“問題是大多數(shù)人都不知道何處需要優(yōu)化。坦率地說，Western blot檢測過程耗時太長。如果每個印跡實驗都有花費你兩天時間，那么還有多少時間確實能用于優(yōu)化Western blot呢？”當然，類似抗體質(zhì)量，封閉液和轉(zhuǎn)印效率等因素也扮演了關(guān)鍵角色，讓我們來仔細看看，現(xiàn)今還有哪些優(yōu)化的技巧和工具。
加入合適數(shù)量的蛋白
雖然步驟優(yōu)化至關(guān)重要，但是傳統(tǒng)的Western Blot整個過程本身過長確實也帶來了困難。Short相信一個成功的Western Blot實驗操作指導中，最重要的因素之一就是確定每份凝膠中加入的蛋白量。
“這是非常重要的，因為大多數(shù)進行WB實驗的研究人員都有一個興趣蛋白，需要與內(nèi)參（看家蛋白）比對”，Short說，“如果您的興趣蛋白是一個低表達的蛋白，而你的內(nèi)參蛋白是一種高表達的蛋白，那么在檢測的動態(tài)范圍內(nèi)就必須有兩種蛋白，以確保結(jié)果的可靠性。因此可能需要加大低表達蛋白的數(shù)量，大概有50-60ug蛋白，但在這個量上內(nèi)參蛋白信號可能會遠遠超出了線性檢測范圍了。了解這些動力學對于Western blot獲得好結(jié)果十分重要。
有效的封閉：脫脂牛奶以外
使用正確的封閉液將獲得完全不同的一個結(jié)果。雖然牛奶是經(jīng)常被使用到的封閉液，但現(xiàn)如今這種封閉液也許不如高質(zhì)量商業(yè)化的封閉液。“封閉液應(yīng)該結(jié)合到膜上不與相應(yīng)抗體結(jié)合的區(qū)域”，Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示，“如果做不到這一點，你會看到斑點和增加的背景”。
目前Western市面上一些封閉液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer，LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer，以及來自Bio-Rad的PBS（含有1%酪蛋白封閉液）。
“研究人員耗費大量的時間去去調(diào)整，檢測各種一抗和封閉液”，“抗體的性能在與與正確的封閉液作用的時候，會得到顯著改善”，LI-COR Bioscience公司的生化產(chǎn)品技術(shù)專家Shawn Mischnick說。
化學發(fā)光檢測：選擇一個長時穩(wěn)定的信號
優(yōu)化過程中另外重要的一點就是，檢測信號的質(zhì)量和穩(wěn)定性，Advansta公司首席科學家Dmitry Bochariov說，“底物信號長時穩(wěn)定，這有助于減少底物和培養(yǎng)基之間不一致性造成的相關(guān)變量，以及當印跡成像和曝光時產(chǎn)生的變量，”Bochariov說，“控制和復制這些變量是非常困難的，因為它們涉及人工處理的印跡，帶有保護層，并且與記錄工具，或者成像系統(tǒng)設(shè)備等其它人為因素有關(guān)。這些因素長期穩(wěn)定的化學發(fā)光輸出，可以大大彌補所有這些變量。”
比如說Thermo Scientific化學發(fā)光底物SuperSignal Substrates，就有針對三個不同靶標水平的試劑（皮克，中級豪微克，低級飛克）。
放大低表達蛋白信號的另一種工具就是Thermo Scientific的新產(chǎn)品：SuperSignal Western Blot Enhancer，這是一種增強劑，包含有兩種試劑：抗原預(yù)處理液和一抗稀釋液，能將信號強度和靈敏度提高3-10倍，從而顯著降低背景，并增強低豐度和弱免疫反應(yīng)性抗原的檢測。
SuperSignal增強劑使用起來也很簡單。在轉(zhuǎn)印之后，封閉之前，用足量的抗原預(yù)處理液浸泡膜10分鐘。一抗雜交前用一抗稀釋液稀釋一抗。其他操作均按照Western blotting的標準操作流程進行。此增強劑可用于PVDF膜或硝酸纖維素膜，并與熒光、比色法和化學發(fā)光檢測兼容。
“增強劑不僅增加了信號，使得抗原表位更加容易接近一抗，而且也降低了背景，”Rangaraj說，“這對于低豐度，或弱免疫反應(yīng)的抗原或蛋白，特別有用的”。而且，配合上Thermo Scientific的MYECL™成像儀（能進行WB結(jié)果數(shù)字圖像，檢測和獲。“基于CCD的成像系統(tǒng)具有相比于傳統(tǒng)X光片，高出兩倍的敏感性，以及十倍的動態(tài)范圍，”Rangaraj說。