大家知道，PeproTech的所有細(xì)胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運(yùn)輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20o C或-80o C條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動(dòng)物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，因溶解不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實(shí)際使用中經(jīng)常遇到的問(wèn)題。
應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？
下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4，產(chǎn)品編號(hào)：200-04)的說(shuō)明書(shū)為例，對(duì)細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
拿到重組人IL-4的說(shuō)明書(shū)后，您會(huì)發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。
1. Centrifuge the vial prior to opening
第 1 步：開(kāi)蓋前離心試劑管
PeproTech的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無(wú)菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開(kāi)塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過(guò)離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。
有很多用戶會(huì)問(wèn)一個(gè)問(wèn)題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長(zhǎng)時(shí)間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？
答：有些小型高速離心機(jī)(多為進(jìn)口品牌)的面板上有一個(gè)Spin鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會(huì)自動(dòng)快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到最高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個(gè)過(guò)程大約30s。這個(gè)Spin鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。
但有些實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有這樣的高速離心機(jī)，只有最高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機(jī)。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達(dá)到類(lèi)似的效果。
2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.
第 2 步：用無(wú)菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。
這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉
用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬(wàn)別。此例中的重組人IL-4需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號(hào)：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1 (產(chǎn)品編號(hào)：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號(hào)：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號(hào)：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的官方說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對(duì)各種溶解液的配制方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。
經(jīng)常有用戶會(huì)問(wèn)，為什么會(huì)有這么多種溶解方法？
答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測(cè)試，說(shuō)明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說(shuō)明書(shū)中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無(wú)法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
有不少用戶沒(méi)注意說(shuō)明書(shū)上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？
答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時(shí)千萬(wàn)不能用PBS或培養(yǎng)液直接來(lái)溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過(guò)。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號(hào)：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號(hào)：100-52)等，說(shuō)明書(shū)上的溶解液即為1x PBS，此時(shí)用PBS溶解完全沒(méi)問(wèn)題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過(guò)最好還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。
2) 一定要溶解到指定的濃度。
蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說(shuō)明書(shū)上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為0.1-1.0 mg/ml。這個(gè)濃度范圍對(duì)于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號(hào)：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B(產(chǎn)品編號(hào)：120-15)則一定要是0.5mg/ml。
高于或低于該濃度范圍會(huì)有什么問(wèn)題呢？
答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過(guò)該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無(wú)法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。
這里所說(shuō)的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。
有用戶會(huì)問(wèn)，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？
答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可