羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序（In situ cell death detection kit-POD法）

一、 原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過(guò)雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。
二、 器材與試劑
器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；
試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、 實(shí)驗(yàn)步驟
操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。
具體操作步驟：
1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
3. PBS漂洗2次；
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；
5. PBS漂洗2次；
6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100μl DNase 1，反應(yīng)在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應(yīng)15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照�？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）
四、 注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí)，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。
3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。
4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。
7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。
8. 試劑保存；未打開的試劑