一般情況下哺乳動物細(xì)胞攝取并表達(dá)外源基因的效率很低，科學(xué)家們因此開發(fā)了轉(zhuǎn)染技術(shù)來克服這個障礙。然而并不是每次轉(zhuǎn)染都能成功，轉(zhuǎn)染成功率可以說已經(jīng)成為了限制性的瓶頸問題，如何提高轉(zhuǎn)染成功率？如何抓住轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵？看看羅氏的專家怎么說？
在通常情況下，哺乳細(xì)胞攝取并表達(dá)外源基因的效率很低，這主要是由于真核細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜是阻止帶電荷分子進(jìn)入細(xì)胞的巨大障礙。目前人們已開發(fā)了數(shù)種轉(zhuǎn)染技術(shù)來克服這個障礙。有了這些技術(shù)后，采用DNA或RNA轉(zhuǎn)染的方法來研究培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)就成為了生物學(xué)研究中的常規(guī)手段。
簡而言之，轉(zhuǎn)染是指將DNA、RNA、蛋白質(zhì)或者其他大分子輸送進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。使用轉(zhuǎn)染技術(shù)的目的包括對基因調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能等進(jìn)行研究。
現(xiàn)已建立并完善了數(shù)種不同的技術(shù)將各種分子，尤其是核酸輸送進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。這些轉(zhuǎn)染技術(shù)是基于三種不同的策略來實現(xiàn)的。（詳情請見www.roche-applied-science.com／transfection）
沒有一種轉(zhuǎn)染試劑是可以普遍適用的
并不是所有的轉(zhuǎn)染技術(shù)都能適用于所有類型的細(xì)胞或?qū)嶒灐２捎貌煌霓D(zhuǎn)染技術(shù)在所能獲得的基因表達(dá)水平方面差異很大。 此外，沒有一種單一的技術(shù)能夠適合于轉(zhuǎn)染實驗所用不同細(xì)胞體系的多樣性。每種轉(zhuǎn)染技術(shù)都會有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而取決因素則包括，例如，需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對于不同的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），或者甚至是對轉(zhuǎn)染應(yīng)用高通量的要求等都會有所影響。但無論在何種情況下，轉(zhuǎn)染成功都取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性、以及重現(xiàn)性這幾個要素。為確保轉(zhuǎn)染的高效性，您需要選擇一種可靠的轉(zhuǎn)染技術(shù)及轉(zhuǎn)染試劑，使之在您的細(xì)胞培養(yǎng)條件下能夠發(fā)揮最佳效果。
為了選擇最符合您需要的轉(zhuǎn)染試劑，您需要檢索有關(guān)您所需的特定細(xì)胞類型或使用方式的現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，考察不同試劑的特點(diǎn)（可在網(wǎng)上獲；請參見www.roche-applied-science.com／transfection）并且，如果可能的話，還要采用有關(guān)試劑所推薦的方案對幾種不同的試劑進(jìn)行測試。
針對特定使用方式的注意點(diǎn)
細(xì)胞生理
為了研究細(xì)胞生理，或用細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)驗證，要注意確保所使用的轉(zhuǎn)染過程本身不會改變研究目標(biāo)的效應(yīng)途徑，或者如果有所改變的話，其改變程度也應(yīng)盡量減小。如果您所用的轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有害，那么就很難區(qū)分所產(chǎn)生的效應(yīng)到底是出自轉(zhuǎn)染過程本身還是被轉(zhuǎn)染的特定基因。正因為這個原因，一定要同時轉(zhuǎn)染空載體或含有無關(guān)基因的載體作為空白對照。僅有如此您才能對目標(biāo)基因所產(chǎn)生的效應(yīng)做出評價。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，您總是希望能獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，并且盡量減小相差顯微鏡下可見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在使用我們的兩種轉(zhuǎn)染試劑FuGENE® 6和FuGENE® HD對細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染研究中，我們采用了微陣列分析方法，來確定基因表達(dá)上調(diào)或者下降的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們的這些試劑和其他同類試劑（見參考文獻(xiàn)）相比較，對試驗細(xì)胞所產(chǎn)生的非目標(biāo)效應(yīng)要少許多。
使用瞬時轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白
以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，您必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集。而挑選這樣一個細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因為轉(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞其生長速度大大超過轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白。
現(xiàn)在，為了獲得蛋白質(zhì)高表達(dá)，您有了一個更好的選擇，即使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。使用FuGENE® HD轉(zhuǎn)染試劑，您可以在轉(zhuǎn)染后3-7天獲得高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，因為這種轉(zhuǎn)染試劑幾乎沒有細(xì)胞毒性，可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)的細(xì)胞，并且每種能被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都能獲得高產(chǎn)量。
但仍有一些蛋白能獲得比其他蛋白更高的產(chǎn)量。因此，現(xiàn)將一些影響到蛋白表達(dá)高水平的關(guān)鍵因素分列如下：
細(xì)胞系（有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高）
質(zhì)粒骨架（例如：增強(qiáng)子，啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件）
目標(biāo)蛋白（有些蛋白很難獲得高表達(dá)量）
目標(biāo)蛋白的cDNA序列（例如：密碼子的優(yōu)化）
培養(yǎng)條件（營養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物）
當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（轉(zhuǎn)染試劑－質(zhì)粒）后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克隆。
瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的比較
制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的第一步是選擇一種同時含有選擇性標(biāo)記物和目標(biāo)基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。
一旦選好了質(zhì)粒載體，無論短暫或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，直到加入選擇性試劑。這樣就使細(xì)胞有時間表達(dá)足量