V13241試劑盒利用了明亮綠色熒光 Alexa Fluor 488 annexin 和紅色熒光碘化丙啶PI核酸染料的即用型溶液。碘化丙啶使壞死細(xì)胞著色，發(fā)出紅色熒光。 在用兩種探針處理之后，凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光，死細(xì)胞顯示紅色和綠色熒光，活細(xì)胞顯示很弱的熒光或不顯示熒光。

實(shí)驗(yàn)方法：

該實(shí)驗(yàn)采用的是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的喜樹(shù)堿誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞系凋亡實(shí)驗(yàn)條件。其他類型的細(xì)胞需做相應(yīng)調(diào)整。

該試劑盒在傳統(tǒng)及Attune™聲波聚焦流式細(xì)胞儀上驗(yàn)證過(guò)，使用Attune™聲波聚焦流式細(xì)胞儀時(shí)，各種流速（25 μL/min 到 1,000 μL/min）都可以。

1.用有效方法誘導(dǎo)凋亡；設(shè)一不加誘導(dǎo)的陰性對(duì)照。

2.孵育之后收集細(xì)胞并用冷的PBS洗滌。

3.制備1×annexin V 結(jié)合緩沖液：按10次分析的量計(jì)算，加1 mL試劑C到4ml的去離子水中。

4.制備100μg/mL的PI工作液：用45μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液稀釋5μl試劑B，剩余可保存?zhèn)溆谩?/span>

5.再次離心步驟2中收集的細(xì)胞，棄去上清，重懸在1×annexinV 結(jié)合緩沖液。計(jì)數(shù)并用上述緩沖液稀釋至約1 × 106 cells/mL。按每次實(shí)驗(yàn)用量100μl準(zhǔn)備充分。

6.在每100μl細(xì)胞懸液中加入5μl試劑A和1μl步驟4制備的PI工作液。

7. 室溫孵育15min。

8. 孵育結(jié)束，加400μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液，輕輕混勻后置于冰上。

9.盡快對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行分析。可用FL1檢測(cè)530nm激發(fā)光，F(xiàn)L3檢測(cè)>575nm的激發(fā)光。細(xì)胞群將被分為三組：活細(xì)胞顯示弱熒光，凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光，而死細(xì)胞則同時(shí)發(fā)紅、綠熒光。

10. 可用熒光顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果，適用檢測(cè)FITC、TRITC或Texas Red®的濾光片檢測(cè)。